P450催化的联芳基偶联反应-文献精读72

Chemoenzymatic Synthesis of Fluorinated Mycocyclosin Enabled by the Engineered Cytochrome P450-Catalyzed Biaryl Coupling Reaction

经工程化的细胞色素P450催化的联芳基偶联反应实现氟代麦环素的化学酶促合成

摘要

将氟原子引入天然产物有望生成具有改良或新颖药理特性的氟代分子。酶促氧化的碳-碳偶联反应是合成联芳结构的一种简单策略，但利用该方法生产氟取代天然产物衍生物的探索仍不充分。在本研究中，我们报道了通过蛋白质工程改造来源于结核分枝杆菌的细胞色素P450（MtCYP121），用于构建一系列具有自然界中新颖氟取代麦环素的衍生物。该方法利用了一种“混合”化学酶促程序，包括酪氨酸苯酚裂解酶催化的氟酪氨酸合成（以市售氟代苯酚为原料）、分子间化学缩合生成二酪氨酸、以及经工程化的MtCYP121催化的分子内双酚偶联反应，以完成张力大的大环结构。计算机制研究表明，MtCYP121通过Cpd I从底物的近端酚羟基抽取氢原子以触发反应。随后构象变化使得两个酚羟基足够靠近，在一个水分子的帮助下发生分子内氢原子转移。最终的双自由基偶联过程完成了分子内C–C键的形成。研究发现，生物芳基偶联反应的效率受不同氟取代影响，主要是由于不同的结合构象所致。

引言

引入氟原子到有机小分子中，通常能够改善其物理化学和药代动力学性质，从而提高药物潜力。(1−5) 因此，有机合成领域的大量研究集中在开发新的试剂和氟化/氟烷基化反应，以制备氟有机化合物。(6−10) 相比之下，生物催化策略在有机氟化学中的应用较少，尽管它更符合绿色和可持续化学的原则。(11−13) 这可能是由于氟化物的生物毒性，(14,15) 氟化酶的稀缺，(16,17) 以及复杂的氟化物消除过程。(18,19) 为克服这一瓶颈，Süssmuth、Moore、Chang、O’Connor、Hailes和Grininger等研究团队最近探索了酶的底物宽容性，通过前体定向生物合成为多种药理学重要的天然产物（如生物碱、非核糖体肽和聚酮化合物）提供了氟化类似物的新途径。(29) 尽管取得了显著进展，通过合成化学和蛋白质工程相结合的突变合成来拓展氟代天然产物衍生物的化学空间仍然不足，需进一步研究。(30−32)

联芳结构在许多天然产物、生物聚合物和药物中频繁出现。(33−36) 例如，次级代谢产物万古霉素（一种糖肽类抗生素）、(37,38) 芳香霉素(39) 和麦环素(40) 都含有环内的联苯基团（图1a，顶部）。近年来，对卤素化天然产物的设计与合成越来越受到关注。(41) 例如，Wright等在2002年记录了含有刚性七肽核心的氯代万古霉素（A47934）的生物合成（图1a，左侧），(42) 而Molinaro等报道了通过工程化来源于链霉菌的细胞色素P450来实现分子内氧化联苯偶联反应，从而构建溴代芳香霉素核心（图1a，中间）。另一方面，麦环素是一种从结核分枝杆菌中分离得到的二肽次级代谢产物，由Belin及其同事于2009年发现。(40) 先前的研究表明，一种独特的P450酶（CYP121）负责形成联苯C–C键，从而构建麦环素中的高度拥挤的大环骨架。(44−49) 然而，据我们所知，MtCYP121的蛋白质工程研究尚未取得突破，特别是带有卤素原子修饰的非天然麦环素衍生物的结构多样性仍未充分探索（图1a，右侧）。在此背景下，我们开始了“混合”化学酶促合成氟代麦环素的项目（图1b）。然而，需考虑多个挑战。首先，所需反应涉及环状二肽的两个芳香C–H键的直接氧化偶联，以形成张力较大的大环。(50−54) 其次，引入氟原子到苯酚中将使苯环相对电子缺乏，从而增加氧化C–C交叉偶联反应的难度。(55,56) 此外，在P450酶催化的氧化条件下，常观察到氟的消除。(18,19) 为解决这些潜在问题，我们首先提出了一种新的级联化学酶促途径，以绕过依赖tRNA的环肽合成酶用于二肽合成（图1b，底部）。(57) 其次，我们设想通过MtCYP121的定向进化重新塑造其催化口袋，可能提高对非天然氟代底物的选择性和活性。(58−61) 此外，Liu等最近披露了MtCYP121通过催化过氧化物旁路路径执行二酪氨酸的分子内C–C交叉偶联反应。(62,63) 鉴于P450的“过氧化物旁路路径”可使用低成本的过氧化氢（H2O2）作为氧和电子供体，从而无需昂贵的NADPH和复杂的氧化还原伙伴激活双氧，(64−68) 我们计划采用CYP121–H2O2系统来研究联苯偶联反应。在此，我们报道了一个化学酶促平台的发展，用于从简单氟代苯酚出发，在制备规模上合成一系列氟取代麦环素衍生物（图1b，底部）。定向进化的细胞色素P450确定了一种MtCYP121双突变体（Q385A/A167M），能够高效催化联苯C–C键的形成，从而完成具有挑战性的宏环核心。进一步进行了计算机制研究，以阐明反应机制和氟取代的影响。

酶促氧化联苯偶联反应以获取含卤联苯基天然产物衍生物

结果与讨论

氟取代二酪氨酸的制备

我们的研究从市售的氟代苯酚1出发，制备各种氟取代的二酪氨酸5（见图2）。使用来自弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii，WP_086550791.1）的吡哆醛5-磷酸（PLP）依赖性酪氨酸苯酚裂解酶（TPL）作为酶，将苯酚与铵离子和丙酮酸转化为相应的酪氨酸。(69−71) 该实用方案表现出较好的稳定性和良好的规模化潜力，如在Boc保护/脱保护步骤后，以适中分离收率和高纯度制备出克级3-氟酪氨酸（2a）、2-氟酪氨酸（2b）、2,3-二氟酪氨酸（2c）和四氘代酪氨酸（2d）（实验细节见支持信息）。随后，Boc-酪氨酸3与酪氨酸-OMe 4在DCC（N,N′-二环己基碳二亚胺）和Et3N的作用下发生分子间缩合，并经甲酸脱保护，生成了一系列氟取代的二酪氨酸5，在克级规模上具有一般可接受的分离收率。两个相同的氟酪氨酸（2a和2b）的偶联可得到对应的对称二聚体5a和5f。或者，通过探索不同组合，可以增加环二肽的结构多样性，从而获得单氟取代的二酪氨酸5b–5d，二氟取代的二酪氨酸5e和5g，三氟取代的二酪氨酸5h，以及四氟取代的二酪氨酸5i。

氟取代二酪氨酸5的制备（以氟代苯酚1a为原料）

制备模型底物2a的一般步骤：在5 L反应器中加入醋酸铵（18.50 g，240.01 mmol，1.5倍当量）、吡哆醛磷酸（160.0 mg）、丙酮酸（42.24 g，479.67 mmol，3.0倍当量）和2-巯基乙醇（3.12 g，39.93 mmol，0.25倍当量）。然后加入4 L pH为7.4的100.0 mM PBS缓冲液和氟代苯酚1a（162.36 mmol，1.0倍当量），搅拌至所有反应成分完全溶解。使用6.0 M NaOH将溶液pH调整至8.2，然后加入4.0 g粗酶粉CfTPL。得到的粗产物经过Boc保护/脱保护步骤，得到氟酪氨酸2a。其他氟酪氨酸2b–2c和氘标记的2d按照此通用步骤制备。

制备模型底物5a的一般步骤：将2a（10.05 mmol，1.0倍当量）和MeOH（10 mL）混合物冷却至0 °C，并用亚硫酰氯（1.78 g，15 mmol，1.5倍当量）处理，生成4a。然后，将3a（10.0 mmol，1.0倍当量）、4a（10.00 mmol，1.0倍当量）、DCC（2.06 g，10.0 mmol，1.0倍当量）溶于4:1 MeCN:DMF（50 mL），加入NEt3（1.01 g，10.0 mmol，1.0倍当量），在室温下反应，生成二酪氨酸5a。其他氟代二酪氨酸5b–5i也按照此通用步骤制备。实验细节见支持信息。

反应优化和酶定向进化

在手中获得了一系列氟取代的二酪氨酸后，我们接着探索酶促分子内氧化C–C偶联，以形成联苯基连接。在自然界中，MtCYP121可催化二酪氨酸（cYY，环-(L-酪氨酸-L-酪氨酸)）转化为麦环素，使用铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶系统以及NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。(40) 使用环-(3-氟酪氨酸-3-氟酪氨酸) 5a作为模型底物，在H2O2存在下探测野生型MtCYP121（GenBank ID: ANZ82981.1）的反应性（图3a）。令人鼓舞的是，通过全面评估反应参数，发现目标分子内偶联反应可以在NaHCO3/Na2CO3缓冲液（pH = 9.4，使用10% v/v DMSO作为共溶剂以提高底物溶解性）和60 mM H2O2（分批加入）的条件下进行（底物浓度为3 mM；筛选详情见支持信息），尽管仅有34%的转化率。用其他氧化剂如过乙酸（PAA）或二叔丁基过氧化物（DTBP）代替H2O2时，仅获得约10%的5a转化率。

模型反应优化与CYP121突变体的高通量筛选

为加速筛选大量蛋白变体库，首先基于高效液相色谱（HPLC）分析中底物5a与产物6a的吸光度差异，建立了适合高通量的分析方法（图3b，详细信息见SI第2.6节）。(72,73) 确定315 nm为最佳波长，因为在此波长下反应混合物的吸光度对不同底物浓度变化最大（图3b-1）。在315 nm处，底物5a的峰几乎消失，系统吸光度主要由产物6a的浓度贡献（图3b-2）。进一步分析确认了底物浓度与反应混合物吸光度之间的线性关系[相关系数(R²)=0.97]（图3b-3），表明通过在微孔板上监测反应混合物的吸光度可以确定底物5a的转化率。HPLC中产物峰面积与反应混合物吸光度的线性关系[相关系数(R²)=0.99]表明反应混合物吸光度变化与产物6a的浓度密切相关（图3b-4）。因此，基于这些分析和对背景干扰及空白对照实验的评估，结果表明这种基于吸光度的高通量筛选（HTS）方法是检测底物转化率的可靠方法。此HTS方法可指示潜在的正突变体，之后通过克级实验的HPLC分析确定精确的转化率。

接下来，进行了多轮定向进化以提高MtCYP121在氧化偶联二酪氨酸5a生成联苯产物6a方面的活性。(74) 基于MtCYP121的晶体结构（PDB: 3G5H）及先前的机制研究，(40,44−49) 首先构建了位于催化活性位点周围的三个关键位点（S237、Q385和R386）的位点饱和突变库（图3c-1，以往研究发现了底物二酪氨酸与S237、Q385、R386及水分子的特殊氢键网络(40)）。通过在96孔板中进行快速筛选，发现Q385位的Gln突变为Ala可显著提高5a的转化率，从34%提升至克级实验中的45%。随后，利用位点饱和突变针对直接底物结合位点和水辅助的间接氢键结合位点（T77、V83、N85、M86、A178、N181和W182）生成蛋白变体（图3c-2）。然而，未观察到比野生型MtCYP121更高催化性能的变体。最后，通过在活性位点5 Å范围内的随机突变筛选了其他变体：M62、V78、V82、V83、A167、F168、W182、V228、T229、G232、A233、F280和H343（图3c-3），最终发现了几个具有较高催化性能的双突变体，包括Q385A/A167M（86%转化率）、Q385A/G87A（69%转化率）和Q385A/G87Q（82%转化率）。进一步的组合突变生成了两个三突变体（Q385A/A167M/G87Q和Q385A/A167M/G87A），但未见显著活性提升（图3c-4）。因此，通过三轮蛋白质工程的迭代优化，将目标氧化交叉偶联反应的转化率从34%逐步提高至86%（图3c-4）。稳态动力学分析表明，MtCYP121-M2变体催化氧化偶联反应的周转数（kcat）为468.3 s⁻¹，米氏常数（KM）为1.344 mM（野生型MtCYP121的kcat=233.8 s⁻¹，KM=1.778 mM）。

底物范围

接着，以MtCYP121-M2变体（Q385A/A167M）为模型，在优化条件下对二酪氨酸5a–5i的底物宽容性进行了简要探索（图4）。单氟取代的麦环素衍生物6b在50%的cYY 5b转化率下获得。值得注意的是，此反应中C–H键与C–D键的偶联是可行的，生成了三氘代麦环素衍生物6c。(75,76) 在苯环3位含有一个氟原子的二酪氨酸5d对MtCYP121-M2的反应性明显较低，仅有微量转化率。而含3-和2'位氟原子的底物5e表现出中等反应性，含3-和3'位氟原子的5f则未检测到转化。这些结果表明2-位取代有利于氧化偶联过程，而3-位取代不利。含有两个氟原子的cYY 5g在一侧苯环上转化为对应的大环产物6g，转化率为45%。值得注意的是，含有三氟原子的cYY 5h与MtCYP121-M2兼容性良好，生成对应的三氟麦环素衍生物6h，转化率为90%。最后，在标准条件下，未观察到四氟化底物5i的转化。

氟取代麦环素衍生物的底物范围

一般步骤：向八个96深孔板的每孔中加入Q385A/A167M突变体的细菌溶液（800 μL，0.125 g/mL，Na2CO3/NaHCO3缓冲液，pH=9.4）、5a溶液（50 μL，3 mM，DMSO中）、6 U DNase I和1 mg/mL溶菌酶，以800 rpm在30 °C摇动，每隔30分钟加入10 μL 600 mM的H2O2共10次。

为验证此方法的实用性，对模型底物cYY 5a进行了克级反应（图5a）。如图所示，100 mL H2O2通过注射泵缓慢加入到含有搅拌棒的1 L反应混合物中。几乎观察到底物5a的完全转化，经过Bn保护-脱保护步骤后，得到高纯度的产物6a，最终分离收率为251 mg/L（实验细节见SI）。此外，将化合物6a与4-硝基苄溴处理得到保护产物7，收率为93%，并通过单晶X射线晶体学分析成功确认其结构。

氟代麦环素衍生物的放大反应及其X射线结构

计算机制研究

麦环素的生成机制

基于分辨率为1.40 Å的结核分枝杆菌CYP121的X射线晶体结构（PDB 3G5H），(40) 构建了初始计算模型。首先，将整个系统溶解到半径为37 Å的预平衡TIP3P水球中。随后，使用CHARMM全原子力场及CHARMM程序进行40 ns的动态模拟以平衡系统。最终选择40 ns时的快照用于后续的QM/MM计算。在QM/MM计算过程中，将系统分为两个区域：QM区域和MM区域。QM区域包含轴向配体Cys345、Cpd I、底物（cYY）、两个水分子（Wat285和Wat329）以及Ser237和Arg386的侧链。QM区域通过量子力学描述，QM区域之外的其他原子（MM区域）则通过分子力学处理。QM/MM计算采用Chemshell软件包，分别使用DL_POLY和TURBOMOLE程序计算MM和QM区域。计算细节详见支持信息。

在双重态下优化的酶–底物复合物结构如图1a所示。底物cYY呈现出与晶体结构（PDB 3G5H）一致的构象。(40) 在水分子Wat285的辅助下，Cpd I可以轻松从底物cYY的近端酚羟基中抽取氢原子，生成自由基中间体IM1，其对应的能垒为10.6 kcal/mol（图1b,c）。接下来，考虑内部氢原子转移过程以生成远端酚自由基。(47,62,77−79) 然而，由于两个酚羟基之间的距离较远，此步骤具有较大的难度。在此背景下，IM1的构象变化被认为参与了后续反应。(80) 估计此构象变化在酶的活性位点中具有约6.0 kcal/mol的较低能垒，对应的中间体IM2的相对能量与IM1相似（图1d和图2a）。发现自由底物的构象变化仅对应约5.0 kcal/mol的能垒。

(a) 酶–底物复合物的优化结构，记为R。 (b) 通过氢原子抽取生成的自由基中间体（IM1）。 (c) 氢原子抽取的能量曲线。 (d) 构象调整后的自由基中间体（IM2）。

(a) 分子内氢原子转移和C–C偶联的计算能量曲线。 (b) 分子内氢原子转移过程中过渡态和中间体的优化结构。

在生成IM2后，发生分子内氢原子从远端酚羟基转移至近端氧自由基，从而激活远端芳香环。根据我们的计算结果，IM2的分子内氢原子转移需要一个口袋水分子（Wat329）的辅助，并对应一个20.0 kcal/mol的能垒，生成远端酪氨酸自由基中间体IM3（图2）。在先前的研究中，(47,62) 曾建议IM3的生成可能遵循PCET机制。然而，我们发现自旋分布数据支持氢转移过程。在接下来的步骤中，Fe(IV)–OH（Cpd II）从近端羟基中抽取氢，生成双自由基中间体IM4。值得注意的是，IM4中的两个自由基在整个芳香环上离域，从而发生双自由基偶联并形成C–C键。我们的计算表明，分子内氢原子转移（从IM2到IM3）是速率限制步骤。IM5的最终芳构化过程被计算为非酶促反应，可通过弱碱催化实现。

反应机制中氟取代的效应

根据我们的实验结果，氟取代的二酪氨酸5a–5i在C–C偶联反应中的转化率不同。特别是，在MtCYP121-M2变体（Q385A/A167M）催化下，底物5a（2,2′-双氟取代）在生成6a时的转化率最高（86%），而底物5f（3,3′-双氟取代）则完全无活性。为了理解氟取代效应的原因，我们首先计算了不同氟取代的二酪氨酸中IM2到IM3的分子内氢原子转移的能垒，这是速率限制步骤。然而，计算结果表明氟原子位置对反应能垒没有明显影响（详见支持信息）。通过检查5a和5f的两个芳香环的自旋分布，我们也没有发现这两种底物之间有显著差异。因此，合理推测氟取代对IM2到IM3的分子内氢原子转移影响不大。

接下来，我们比较了天然底物cYY (5)和氟取代cYY 5a–5h在C–C键形成步骤的计算能垒，结果显示没有显著差异（详见支持信息）。在这一阶段，我们进一步考虑了可能影响氟取代二酪氨酸反应速率的其他因素。为对比，我们进一步使用5、5a和5f作为底物进行分子对接，并进行了MD模拟。结果显示氟原子的位置确实对底物的结合构象有显著影响（详见支持信息）。例如，2,2′-双氟取代的底物5a与天然底物5相比，表现出几乎相同的结合构象（图3）。然而，3,3′-双氟取代的底物5f则表现出完全不同的结合构象。这种构象差异可能导致在相同的CYP121突变体催化下产生不同的反应表现。这些初步结果表明，氟取代不会影响活性位点中底物的化学反应性，但会通过构象变化影响底物的动态性，最终影响整体的联芳偶联反应效率。我们通过突变口袋残基提高CYP121活性这一事实也支持了上述推测。

从100 ns的MD模拟中获得的MtCYP121-M2变体（Q385A/A167M）与底物（5、5a、5f）复合物的最终平均结构。

结论

总之，我们成功开发了一条化学酶促途径，用于合成具有新颖性的氟代麦环素，其中包括两个酶促反应和一个化学缩合转化。该方案的关键在于将细胞色素P450 MtCYP121工程化为双突变体，使其能够催化两个C–H键的分子内氧化偶联形成一个C–C键，从而组装出具有挑战性的张力大环结构。此酶促联芳偶联反应使用廉价的H2O2作为终端氧化剂，接受多种二酪氨酸底物，并且可以顺利放大至克级规模。计算机制研究揭示了反应机制，包括Cpd I首先进行氢原子抽取、底物构象变化、分子内氢原子转移（速率限制步骤）、Cpd II的第二次氢原子抽取，以及最终的双自由基偶联形成C–C键。我们的研究表明，底物的构象变化在促进随后的两个羟基之间的分子内氢原子转移中起到了重要作用。氟取代可能导致不同的结合构象，从而导致不同的联芳C–C偶联反应转化率。结构上看，构建合适的催化口袋以容纳氟代底物并允许中间体的构象变化，可能是进一步提高酶效率的关键。我们期待本研究不仅为具有挑战性的联芳分子的化学酶促合成开辟新的机会，还能为结核病领域的潜在药物研究提供新颖的氟代化合物。