Nature 正刊丨阻断翻译的mRNA ADP核糖基转移酶的抗病毒防御

01摘要

宿主与病原体的冲突是分子创新的熔炉1,2。对病原体的免疫选择推动了整个生物学中复杂免疫机制的进化，包括细菌对噬菌体的防御3。在这里，我们描述了广泛分布的抗噬菌体防御系统CmdTAC，它提供了对T-even噬菌体家族感染的强大防御4。我们的研究结果支持了一种模型，在该模型中，CmdC通过感应病毒衣壳蛋白来检测感染，最终导致有毒的ADP核糖基转移酶效应蛋白CmdT的激活。我们发现，新合成的衣壳蛋白会引发伴侣CmdC与CmdTAC复合物的解离，导致抗毒素CmdA的不稳定和降解，从而释放CmdT-ADP核糖基转移酶。值得注意的是，CmdT不靶向蛋白质、DNA或结构化RNA，这些是其他ADP核糖基转移酶的已知靶点。相反，CmdT改变了单链RNA中GA二核苷酸中腺嘌呤的N6位置，从而阻止了mRNA翻译并抑制了病毒复制。我们的工作揭示了一种新的抗病毒防御机制，以及一类以前未知但分布广泛的靶向mRNA的ADP核糖基转移酶。

02图表简介

a、 指示HHpred预测的结构特征的cmdTAC操纵子（NCBI蛋白RCP66309-11.1）示意图。ART，ADP核糖基转移酶。b、 将十倍连续稀释的T4噬菌体在大肠杆菌菌株ECOR22和ECOR22ΔcmdTAC突变体的草坪上贴板，该突变体在其天然启动子下没有或有含有cmdTAC的低拷贝质粒。c、 相对于空载体对照，大肠杆菌K-12+cmdTAC上噬菌体的铺板效率。参考文献4中的T2、T4和T6数据。d、 T4在大肠杆菌K-12+cmdTAC或空载体（EV）中的爆发大小（30°C下1小时）。数据为平均值±标准差。；n=5个生物重复。e、 大肠杆菌K-12+cmdTAC或空载体的生长，并以指定的MOI感染T4。中心线表示平均值，阴影区域表示95%的置信区间；n=6个技术复制品；代表3个生物复制品。f、 AlphaFold2预测了CmdTAC复合物的模型，插图显示了CmdT与ADP核糖基转移酶外毒素A（蛋白质数据库（PDB）1AER，均方根偏差（r.m.s.d.）6.93Å）和CmdC单体与SecB伴侣单体（PBD 1OZB，r.m.s.d.4.13Å。r.m.s.d.值由Foldseek生成。

a、 含有空载体或指定成分并用0.2%阿拉伯糖诱导的启动子诱导的菌株的平板活性（十倍连续稀释）（Para）。b、 通过在LB+阿拉伯糖（顶部）上生长来评估表达cmdT或cmdTA的细胞的板活性，并通过天然凝胶的免疫印迹（中间）或SDS-PAGE（底部）来评估cmdT的表达。加载控制如扩展数据图3c所示。c、 通过免疫印迹（左）和在LB+阿拉伯糖上的平板存活率（右）评估表达cmdTA的MG1655野生型或MG1655ΔclpP细胞的CmdA水平，其中cmdTA N末端有3×HA标签。d、 表达带有N端3×HA标签的CmdA的cmdTA的细胞。细胞还含有空载体或四环素诱导型启动子控制下的cmdC载体。通过免疫印迹法测量CmdA水平（左），并通过在LB上用诱导剂连续稀释十倍来评估细胞存活率（右）。e、 携带cmdTAC的细胞的免疫印迹，其中CmdT和CmdA分别在其C和N末端具有Flag或3×HA标签。从感染T4的细胞中采集的样本。加载控制如扩展数据图3e所示。f、 用空载体或指定质粒在MG1655野生型或MG1655ΔclpP大肠杆菌上连续稀释十倍的T4噬菌体。g、 通过免疫印迹（左）评估具有cmdTAC（N端3×HA标记的CmdA）和表达额外拷贝cmdC（底部）或不表达（顶部）的细胞的CmdA水平，并通过十倍连续稀释的T4质粒（右）评估防御。h、 用T4噬菌体感染携带cmdTAC的细胞后0和15分钟，对与N-末端Flag标记的CmdC共沉淀的蛋白质进行IP–MS/MS分析。i、 携带cmdTAC的未感染大肠杆菌细胞的生长，如所示，表达Gp23和Gp31。中心线表示平均值，阴影区域表示95%的置信区间。n=3个生物重复。

a、 ADP核糖抗体用于免疫印迹（顶部）或DNA和RNA斑点印迹（底部），如所示。左上角，从表达cmdTA或含有空载体的细胞中采集的样本，诱导后60分钟。右上角，从在其天然启动子下表达cmdTAC或携带空载体并用T4噬菌体感染32分钟的细胞中采集的样本。通过SDS-PAGE分离蛋白质；DNA和RNA样品被点在尼龙膜上。亚甲蓝染色显示总RNA和DNA。b、 AlphaFold2预测了CmdT的结构（左），其中保守的芳香族残基和推定的催化残基（见图3a）以绿色显示，并带有相应的静电表面表示。色条单位为kcal/（mol·e）（右）。c、 将来自指定菌株和条件的RNA样品在琼脂糖凝胶上分离，然后用溴化乙锭（EtBr）染色以显示总RNA，或用抗ADP核糖印迹以显示ADP核糖基化RNA。蛋白质在磷酸化前通过SDS-PAGE进行解析。来自两个独立生物复制品的代表性图像。e、 以编码二氢叶酸还原酶（DHFR）的DNA为模板的体外转录-翻译反应。在指示的地方加入纯化的CmdT和NAD+，通过考马斯染色观察DHFR的产生。c表示对照洗脱液（模拟纯化）。DHFR带是根据补充图1中的梯形图确定的。f、 体外转录-翻译反应使用编码DHFR的DNA模板或T7 RNA聚合酶产生的mRNA模板，并在添加前用CmdT（或未标记CmdT的模拟纯化洗脱液）处理。DHFR带分别基于泳道1和4中的阳性和阴性对照进行鉴定。

03 参考文献
Liu Y , Qin Z , Yang X ,et al.High-Voltage Manganese Oxide Cathode with Two-Electron Transfer Enabled by a Phosphate Proton Reservoir for Aqueous Zinc Batteries[J]. 2022.

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