肉桂酰辅酶A还原酶Cinnamoyl-CoA Reductases（CCR）表征及晶体-文献精读70
Structural and Biochemical Characterization of Cinnamoyl-CoA Reductases
肉桂酰辅酶A还原酶的结构与生化表征
摘要
肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）催化羟基肉桂酰辅酶A（CoA）酯的还原反应，利用NADPH生成木质素合成中的羟基肉桂醛前体。通过晶体结构、定点突变、动力学和热力学分析，推导了高粱（Sorghum bicolor）中肉桂酰辅酶A还原酶的催化机制和底物特异性，高粱是一种用于生物能源生产的重要植物。虽然SbCCR1对咖啡酰-CoA或p-香豆酰-CoA的亲和力高于对阿魏酰-CoA的亲和力，但该酶对后者的活性显著更高。通过分子对接和对比葡萄（Vitis vinifera）二氢黄酮醇还原酶与SbCCR1的晶体结构，发现了苏氨酸-154和酪氨酸-310这两个残基与辅酶A结合的苯丙烷类化合物的结合有关。SbCCR1及其他CCR中的苏氨酸-154可能赋予了对阿魏酰-CoA强烈的底物特异性，而SbCCR1中的T154Y突变导致底物特异性更广，反应速率更快。通过利用我们的结构和生化信息进行数据挖掘，从高粱基因组数据中发现了另外四个潜在的CCR基因。其中一个，SbCCR2，显示出比SbCCR1更强的p-香豆酰-CoA活性，这可能暗示其在防御相关木质素合成中的作用。综合来看，这些发现为CCR关键残基和底物偏好提供了新的认识，并首次提供了单子叶植物中CCR的三维结构信息。
肉桂酰辅酶A还原酶（CCR; EC 1.2.1.44）催化植物中单木质素合成的第一个关键反应，它通过NADPH依赖的反应氢化羟基肉桂酰辅酶A硫酯，生成相应的羟基肉桂醛和CoASH。CCR的活性首次由Wengenmayer等人（1976）在大豆（Glycine max）悬浮培养物中报道；Eucalyptus gunnii中CCR cDNA的克隆首次由Lacombe等人（1997）报道。CCR在苯丙烷类途径中的位置使其在引导代谢通量向黄酮类和芪类化合物或单木质素、羟基肉桂酸及（视物种而定）羟基肉桂酰酯方面具有关键作用。最常见的单木质素是p-香豆醇、愈创木酚和丁香酚醇，它们被引导至次生细胞壁，在那里经过氧化偶联形成木质素聚合物。木质素中来源于上述单木质素的结构被称为对羟基苯基（H）、愈创木基（G）和丁香基（S）残基（Ralph等人，2004）。木质素填充了次生细胞壁中由纤维素微原纤维和半纤维素多糖形成的复杂网络之间的空隙。木质素的加入使木质部细胞具有疏水性，并提高了细胞的机械强度，提供结构支撑。木质素还可以作为机械屏障，应对真菌感染或昆虫袭击（Vanholme等人，2010）。
E. gunnii CCR的克隆推动了其同源基因的克隆，这导致在玉米（Zea mays；Pichon等人，1998）和拟南芥（Arabidopsis thaliana；Lauvergeat等人，2001）中鉴定了两个CCR基因。表达研究表明，在这两种植物中，CCR1参与茎组织的木质化，而CCR2参与对病原体攻击的木质化反应。然而，在桶状苜蓿（Medicago truncatula）中，不同的CCR旁系同源物似乎具有不同的底物特异性，其中CCR1对阿魏酰-CoA有偏好，而CCR2对p-香豆酰-CoA和咖啡酰-CoA有偏好（Zhou等人，2010）。通过使用突变体和转基因研究，进一步探讨了CCR在木质化中的作用。在CCR被下调的转基因烟草（Nicotiana tabacum）中，其维管组织壁更薄，维管组织呈棕色，木质素浓度降低，S-G比增加，且生长减少并显示组织异常（Piquemal等人，1998）。这些植物的次生细胞壁中含有酪胺阿魏酸，推测这是积累的阿魏酰-CoA硫酯的汇集处（Ralph等人，1998）。被鉴定出由于木质部坍塌而具有不规则木质部4型突变体（irx4）的拟南芥被证明有缺陷的CCR1基因（Jones等人，2001）。通过转基因下调CCR1可以再现这种表型（Goujon等人，2003）。由于CCR1表达减少导致的多余阿魏酰-CoA被转化为阿魏酰苹果酸（Derikvand等人，2008）。两个独立的拟南芥ccr1突变体含有的木质素比野生型对照少，这些突变体的木质素中H残基比例增加，而S残基比例降低（Van Acker等人，2013）。相比之下，在玉米中，对Zmccr1−转座子插入突变体的分析表明，其CCR1表达残余31%，茎组织中的木质素浓度略有降低，S-G比略有增加，H残基减少。此外，厚壁组织的结构组织受到了影响。该突变体中几个与细胞壁相关的基因的表达降低，而参与黄酮类生物合成的几个基因则显示出较高的表达水平（Tamasloukht等人，2011）。尽管存在物种特异性的差异，但这些数据表明CCR在苯丙烷代谢中具有关键作用，并确保了次生细胞壁的完整性。
虽然木质素在植物存活中起着重要作用，但它也降低了植物生物质的工业利用效率。木质素的存在降低了饲料作物的消化性（Jung和Buxton，1994；Fontaine等人，2003），并阻碍了生物质酶解为可发酵糖的过程，而这些糖可以发酵为可再生燃料和化学品（Chen和Dixon，2007；Van Acker等人，2013）。因此，热化学预处理是必要的，以降低植物细胞壁对纤维素酶的抗性（Hu和Ragauskas，2012；Leu等人，2013）。在此过程中从木质素衍生的酚类化合物对用于发酵的微生物也有害（Ximenes等人，2011）。
C4草本高粱（Sorghum bicolor）因其在恶劣环境下的生长能力（包括贫瘠土壤、高温和长期干旱）而备受关注，作为生产可再生燃料和化学品的木质纤维素原料（Farré和Faci，2006；Wang等人，2014）。通过引入某些棕色中肋（bmr）突变，操控高粱的木质素浓度和木质素亚基组成，已被证明可以改善反刍消化性（Porter等人，1978），并提高高粱生物质的酶解效率（Saballos等人，2008；Dien等人，2009）。考虑到木质素对植物存活的重要作用，降低木质素浓度和/或改变木质素组成可能伴随着产量下降或生物质质量降低的固有风险。然而，使用特定的突变等位基因可以平衡这些影响，例如Bmr12基因，其编码咖啡酸O-甲基转移酶（Bout和Vermerris，2003；Sattler等人，2012）。在此情况下，bmr12-34等位基因将木质素浓度降低到介于野生型高粱和bmr12-ref等位基因（null等位基因）之间的水平，同时仍提供了增强酶解效率的好处（Sattler等人，2012）。
操控单木质素生物合成基因，如肉桂醇脱氢酶（Bmr6；Saballos等人，2009；Sattler等人，2009）和4-香豆酸辅酶A连接酶（Bmr2；Saballos等人，2012），也提高了高粱的生物质转化效率（Saballos等人，2008；Scully等人，2016）。为了最大限度地丰富操控细胞壁组成和重定向代谢流量以生成具有健康促进特性的次生代谢产物的工具库，详细了解参与单木质素生物合成的酶的底物特异性和催化机制至关重要。我们最近报道了羟基肉桂酰转移酶（Walker等人，2013）、咖啡酸O-甲基转移酶（Green等人，2014）和肉桂酰辅酶A O-甲基转移酶（Walker等人，2016）的详细结构和催化分析。虽然先前对CCR的研究为该酶的结构-功能和动力学提供了重要见解（Pan等人，2014），但CCR的底物选择和偏好的结构基础仍然大多未知。在本研究中，我们提供了详细的生化和结构发现，支持我们对CCR底物选择性的区分提出的假设。我们预计这些知识将有助于将高粱工程化为改良的牲畜饲料或生物能源原料。
结果
全局结构
与NADP+复合的重组SbCCR1（Sobic.007G141200）在P32空间群中结晶，其三维结构在2.9 Å分辨率下被确定（表I）。晶格的不对称单元由两个以非晶体学两重对称排列的单体组成，彼此之间的分子间相互作用有限。通过PISA（Krissinel和Henrick，2007）进行的计算，用于评估晶格中相邻单体之间的相互作用以预测生物学相关的寡聚状态，表明SbCCR1在溶液中以单体形式存在（溶剂化自由能增益 = 0.8 kcal mol−1，界面复合显著性评分 = 0.0）。
X-ray diffraction data and refinement statistics for SbCCR1 (PDB identifier 5TQM)
| Parameter | Recombinant SbCCR1 in Complex with NADP+ |
|---|---|
| Space group | P32 |
| Cell dimensions | |
| a, b, c (Å) | 72.194, 72.194, 123.033 |
| α, β, γ (°) | 90, 90, 120 |
| Resolution (Å) | 50.0–2.70 (2.434–2.35) |
| Rsym | 0.155 |
| I/σI | 24.2 (1.51) |
| Completeness (%) | 98.66 (0.98) |
| Redundancy | 5.2 |
| Refinement | |
| Resolution | 41.018–2.9 |
| Unique reflections | 15,697 (1,423) |
| Rwork/Rfree | 0.2280/0.2733 |
| No. of atoms | |
| Macromolecules | 9,796 |
| Ion | 0 |
| Ligand | 210 |
| Water molecules | 0 |
| B factors | |
| Protein | 78.91 |
| Ligand ion | 86.73 |
| Water | 0.00 |
| r.m.s.d. | |
| Bond length (Å) | 0.003 |
| Bond angle (°) | 0.708 |
| Ramachandran angles | |
| Favored | 94.75 |
| Outliers | 0.48 |
| Clash score | 2.25 |
SbCCR1的整体结构由两个结构域组成：一个包含典型Rossmann折叠的N端结构域和一个C端混合α/β折叠结构域，这与双子叶植物矮牵牛（Petunia hybrida）和苜蓿（Medicago truncatula）中CCR的结构相似（Pan等人，2014）。这两个结构域位于两个不同的叶片上，夹在相邻的底物和NADP(H)结合口袋之间（图1）。
图1. SbCCR1与NADP+和手动对接的阿魏酰-CoA复合体的全局结构的带状图。
酶的N末端和C末端分别标记为N和C。链末端的虚线曲线代表由于无序而无法在实验电子密度图中建模的残基。NADP+以棕色碳原子形式呈现在棒状模型中，其位置根据实验复合物中的定位确定。手动对接的阿魏酰-CoA也以灰色碳原子形式呈现在棒状模型中。在反应过程中，底物的硫酯键位于NADPH的烟酰胺环正上方，以促进氢化物转移。在该模型中，酶的两个叶片均有残基参与辅酶A的结合，底物结合时可能会通过构象变化来容纳这种结合。分子图像使用UCSF Chimera软件包生成。
为了在蛋白质数据库（PDB）中识别与SbCCR1结构密切相关的同源结构，使用SbCCR1的原子坐标进行了Dali搜索（Holm和Sander，1993）。匹配度最高的是来自矮牵牛的CCR（PDB标识符4R1S），其Z评分为48.19，随后是来自苜蓿的CCR2（PDB标识符4R1U）和肉桂醇脱氢酶2（PDB标识符4QTZ），它们的Z评分分别为43.4和41.1。来自葡萄（Vitis vinifera）的二氢黄酮醇还原酶（PDB标识符2C29）也高度相似，Z评分为39.7，相关内容将在“讨论”部分进一步探讨。接下来最密切相关的结构是来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲基乙二醛/异戊醛还原酶Gre2（PDB标识符4PVC）、苜蓿的vestitone还原酶，以及酵母Sporobolomyces salmonicolor的醛还原酶2（PDB标识符1Y1P），它们的Z评分分别为35.2、34.5和32.5。
使用BLAST搜索（Altschul等人，1997）在PDB中识别具有相似氨基酸序列的蛋白质，结果显示来自矮牵牛的CCR（PDB标识符4R1S）与SbCCR1的序列相似度最高（75%），其次是来自苜蓿的CCR2（PDB标识符4R1U；71%）、苜蓿的肉桂醇脱氢酶2（PDB标识符4QTZ；49%）和来自葡萄的二氢黄酮醇还原酶（PDB标识符2C29；41%）。根据BLAST输出结果，Dali搜索识别出的其他酶没有显著的序列相似性。
NADPH结合口袋
从结构精细化的早期阶段起，SbCCR1/NADP+复合体的Fo-Fc图就显示出在N末端结构域的深口袋中存在一个清晰的NADP+分子电子密度。该结合区域主要由一个六股平行β片层组成（顺序为β3-β2-β1-β4-β5-β6；图2A），其位置与推测的羟基肉桂酰-CoA结合口袋相对（图1）。结合的NADP+分子的二磷酸基团与酪氨酸42和异亮氨酸43的主链二级胺在氢键作用距离内。此外，NADP+的正电荷似乎通过相邻α螺旋（α1）的巨电偶极矩得到补偿，该螺旋在酪氨酸42和甘氨酸55之间延伸，通过N端封闭（Pereira等人，2001）。NADP+的腺嘌呤环主要与β1的精氨酸63和β2的天冬氨酸89相互作用，而腺苷核糖仅通过其2'-磷酸基团与精氨酸63的侧链形成盐桥结合。简而言之，精氨酸63的胍基通过阳离子-π相互作用与六元杂环结合（图1），而天冬氨酸89的羧基与环上的N6氢原子形成氢键。亮氨酸90的侧链似乎也与整个环进行疏水相互作用。
图2.A, SbCCR1结合口袋中观察到的NADP+。 NADP+及所有相互作用的残基以棒状模型表示。SbCCR1的骨架以带状图表示，虚线表示氢键或离子相互作用。所有参与NADP+结合的残基按其单字母缩写标记，并根据序列位置编号。由丝氨酸149、酪氨酸183和赖氨酸187组成的催化三联体靠近烟酰胺环，促进氢化物转移到羟基肉桂酰-CoA底物上。 B, 手动对接的阿魏醛位于SbCCR1的推测苯丙烷类结合区中。SbCCR1的骨架以带状图表示，突出的侧链以棒状模型表示，这些侧链参与阿魏醛结合。阿魏醛是与优选底物阿魏酰-CoA反应生成的产物，显示为灰色。在T154A和Y310F突变体的动力学实验中，表明这两个残基对于阿魏酰-CoA的苯丙烷部分的结合至关重要。分子图像使用UCSF Chimera软件包生成。 NADP+的烟酰胺环大致平行于一段蛋白质骨架，包括脯氨酸210至缬氨酸213，推测通过疏水相互作用提供了稳定性（图1）。此外，烟酰胺羧酰胺靠近缬氨酸213的骨架胺以及配体的最接近的内磷酸基团，表明这些相互作用也有助于其结合。
羟基肉桂酰-CoA结合口袋
SbCCR1的底物结合域由两组α螺旋包围，底物结合口袋的底部主要由β链组成。第一组螺旋包括α5、α6和α7，第二组螺旋包括α8、α10和α12（图1）。这两组位于相对的叶片上，包围了一组提供推测的苯丙烷结合区域结构完整性的β链（β8、β10、β11和β13）。β8垂直于β10、β11和β13，并夹在三股链和NADP+的烟酰胺环之间。β9和β12呈反平行排列，形成了一个远离烟酰胺环的暴露于溶剂的壁。 为了研究SbCCR1与羟基肉桂酰-CoA底物的苯丙烷部分之间的特定相互作用，进行了多次使用阿魏酰-CoA或阿魏醛的浸泡和共结晶尝试，但均未成功。因此，使用这些化合物进行了分子对接计算。对接计算将阿魏醛的醛基定位在NADP+的烟酰胺环的A面上，呈反式构象（图2B），允许从NADPH的C4原子向底物的反应羰基进行pro-R氢化物转移。阿魏醛的醛基C9原子与烟酰胺环C4原子之间的距离为2.3 Å。配体的疏水体位于异亮氨酸150和缬氨酸211的侧链上。苯丙烷环的3-甲氧基和对位羟基分别延伸至苏氨酸154和酪氨酸310的羟基2.9 Å处。已知的CCR中完全保守的蛋氨酸155似乎位于一个适合的部位，与配体环上的3-甲氧基进行疏水相互作用。
野生型及突变体SbCCR1的等温滴5定量热法 等温滴定量热法（ITC）用于确定潜在底物、产物及其类似物的结合热力学参数。在这些实验中，将配体溶液注入包含蛋白质溶液的量热池中，并记录溶液热力学状态的变化。当NADPH用作滴定剂时，释放了大量热量（ƊH = −6.1 kcal mol−1）。这一焓变伴随着适度的熵贡献（ƊS = 3.2 cal mol−1 K−1），最终得到Kd为6.5 μM（图3A；表II）。当使用NADH作为滴定剂时，未观察到显著的热力学变化，表明该配体未与SbCCR1结合。CoA与SbCCR1的Kd值为25 μM，但SbCCR1对阿魏酸未显示出显著亲和力（图3A；表II）。在没有NADP+的情况下，阿魏酰-CoA与SbCCR1的Kd为13 μM，ƊH和ƊS分别为−8.6 kcal mol−1和−6.4 cal mol−1 K−1。然而，在存在NADP+的情况下，阿魏酰-CoA的结合非常弱或根本不结合。咖啡酰-CoA显示出稍高的亲和力（Kd = 7.2 μM），但同样对酶-NADP+复合体几乎没有亲和力。
图3.A， 野生型SbCCR1与不同配体滴定时的ITC曲线。正如预期的那样，当酶与NADP+、NADPH、CoA和阿魏酰-CoA滴定时，观察到了显著的焓变化。令人惊讶的是，对p-香豆酰-CoA和咖啡酰-CoA也观察到了合理的亲和力。 B， 野生型SbCCR1与T154A和Y310F突变体滴定阿魏酰-CoA时的ITC比较。与T154A（三角形）或Y310F（圆形）的滴定相比，野生型酶（方形）滴定时观察到了显著的热释放。
SbCCR1与各种配体相互作用的热力学性质
| Ligand | Kd | ƊH | ƊS |
|---|---|---|---|
| μM | kcal mol−1 | cal mol−1 K−1 | |
| Feruloyl-CoA (apo form) | 13 ± 1.7 | −8.6 ± 0.6 | −6.4 |
| Caffeoyl-CoA (apo form) | 7.2 ± 0.5 | −29 ± 1.9 | −72.8 |
| p-Coumaroyl-CoA | 2.1 ± 0.2 | −28 ± 0.9 | 23.5 |
| NADPH | 6.5 ± 0.6 | −6.1 ± 0.2 | 3.16 |
| NADP+ | 14 ± 4.7 | −3.1 ± 1.0 | 2.01 |
| CoA | 25 ± 4.0 | −7.2 ± 1.0 | −3.14 |
| NADH | ND | ND | ND |
| Ferulic acid | ND | ND | ND |
| Feruloyl-CoA (NADP+ bound) | ND | ND | ND |
| Caffeoyl-CoA (NADP+ bound) | ND | ND | ND |
野生型SbCCR1或突变体T154A和Y310F与阿魏酰-CoA相互作用的热力学性质
| Plant | Kd | ƊH | ƊS |
|---|---|---|---|
| μM | kcal mol−1 | cal mol−1 K−1 | |
| Wild type | 13 ± 2 | −8.6 ± 0.6 | −6.4 |
| T154A | 37 ± 4 | −8.4 ± 1.6 | −8.1 |
| Y310F | 46 ± 6 | −6.8 ± 0.6 | −3.1 |
在高粱中识别和折叠识别建模CCR候选者
使用SbCCR1的氨基酸序列作为BLAST（Altschul等人，1997）的查询，搜索高粱蛋白质组（Phytozome数据库：https://phytozome.jgi.doe.gov/），以寻找潜在的CCR或CCR类似酶。精细化的搜索结果找到了四个额外的候选者，分别是Sobic.004G065600、Sobic.002G146000、Sobic.010G066000和Sobic.003g116800，它们都包含当前公认的CCR标志序列NWYCY。为了开始研究这些酶是否是真正的CCR，首先使用Clustal Omega对氨基酸序列进行比对，然后将序列截短至晶体结构中观察到的SbCCR1的N端和C端（图4）。截短的序列被提交至折叠识别服务器Phyre2，使用SbCCR1序列作为对照，生成的这四个候选者的三维结构被叠加。观察到每个候选者与SbCCR1之间的广泛对齐，r.m.s.d.值在0.25到0.31 Å之间。推测的催化残基，包括SbCCR1的丝氨酸149、酪氨酸183和赖氨酸187，在所有四个CCR候选者中完全保守，并且位于催化所需的正确位置上（图4）。
图4. SbCCR1及多个相关酶的氨基酸序列的多序列比对。
比对中包含了矮牵牛的CCR1、苜蓿的CCR2、高粱的CCR2、葡萄的二氢黄酮还原酶，以及高粱的五个CCR或CCR类似酶。通过使用SbCCR1的序列作为查询，挖掘高粱蛋白质组数据发现了四个额外的CCR候选者。在这四个额外的候选者中，仅能确认SbCCR2具有较高的CCR活性。比对中所有酶中完全保守的残基用星号标记。黄色高亮的残基位于β链中，而红色的残基位于α螺旋中。参与底物或辅底物结合的残基以粗体加下划线表示。CCR标志序列NWYCY用框标出。高粱中CCR候选者的N端和C端被截短，以尽可能匹配实验观察到的SbCCR1的末端。冒号（:）和句点（.）分别表示强相似特性的保守性和弱相似特性的保守性。
SbCCR1、PhCCR1和MtCCR2的结构比较
为了结构上比较SbCCR1、PhCCR1（PDB标识符4R1S）和MtCCR2（PDB标识符4R1U），这三种晶体结构的原子坐标被提交到软件程序COOT中进行三级结构对齐。叠加的结构显示了参与苯丙烷类和NADP(H)结合的残基以及丝氨酸-酪氨酸-赖氨酸催化三联体的保守性（图4和图5）。唯一显著的区别是，SbCCR1的苏氨酸154在PhCCR1中被酪氨酸替代。由于异构体的差异以及MtCCR2结构中缺乏NADP(H)，预期结果是，SbCCR1与MtCCR2的对齐产生了更高的r.m.s.d.值（1.31 Å），而SbCCR1与PhCCR1的对齐产生了更低的r.m.s.d.值（0.68 Å）。
图5. SbCCR1及其他CCR的三级结构叠加。 图中显示了SbCCR1（蓝色）、PhCCR1（棕色）和MtCCR2（灰色）。催化和苯丙烷类结合的残基，以及SbCCR1和PhCCR1模型中的NADP+，都以棒状模型表示。保守残基根据SbCCR1中的残基类型和序列位置表示。分子图像使用UCSF Chimera软件包生成。
酶动力学
对野生型SbCCR1的酶动力学分析在各种羟基肉桂酰-CoA存在下进行，包括阿魏酰-CoA、咖啡酰-CoA和p-香豆酰-CoA。虽然在咖啡酰-CoA和p-香豆酰-CoA上观察到了较低的活性，但对阿魏酰-CoA的活性则显著更高（图6A）。此外，评估了其三个突变体形式T154A、T154Y和Y310F在阿魏酰-CoA或p-香豆酰-CoA（仅评估T154A和T154Y）存在下的催化活性。T154A和Y310F突变体对阿魏酰-CoA的Vmax值比野生型酶低约5倍，催化效率相对降低，Km值较高（图6B）。然而，T154Y突变体对阿魏酰-CoA和p-香豆酰-CoA的催化效率分别比野生型SbCCR1提高了4.9倍和144倍（表IV）。
图6.A， 野生型SbCCR1在三种羟基肉桂酰-CoA底物存在下的米氏曲线。所有曲线均基于初始速率测量构建。对于每个反应，NADPH的浓度恒定为1 mM，而羟基肉桂酰-CoA底物的浓度则变化。在阿魏酰-CoA存在下，SbCCR1表现出很高的活性，但在咖啡酰-CoA或p-香豆酰-CoA存在下活性较低。 B， 野生型SbCCR1及其两个突变体T154A和Y310F在阿魏酰-CoA存在下的米氏曲线。生成并测试了这两个突变体的活性，观察到两种突变体的活性显著下降。鉴于这两个残基在底物结合口袋中的位置，这些数据表明这两个残基都参与了阿魏酰-CoA的结合。数据使用Origin Pro 2015进行处理。
野生型SbCCR1在三种羟基肉桂酰-CoA底物存在下的动力学数值
| Substrate | Kcat | Km | Kcat/Km |
|---|---|---|---|
| s−1 | μM | μM−1 s−1 | |
| Feruloyl-CoA | 3.96 | 70 | 0.0566 |
| p-Coumaroyl-CoA | 0.05 | 100 | 0.0005 |
| Caffeoyl-CoA | 0.01 | 14 | 0.0008 |
图7.A， 几种形式的CCR在阿魏酰-CoA或p-香豆酰-CoA存在下的反应速率。Sobic.002G146000和Sobic.010G066000使用其基因标识符的最后五位数字表示。 B， SbCCR1中的苏氨酸154和酪氨酸310与阿魏醛的官能团结合。 C， Sobic.004G065600（SbCCR3）活性位点的折叠识别模型。条形图使用Excel 2013（Microsoft）生成。分子图像使用UCSF Chimera软件包生成。
野生型及突变体SbCCR1、SbCCR2、Sobic.002G146000和Sobic.010G066000在阿魏酰-CoA或p-香豆酰-CoA存在下的动力学数值
ND, Not determined.
| Plant | Kcat (s−1) | Km (μM) | Kcat/Km (μM−1 s−1) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Feruloyl-CoA | p-Coumaroyl-CoA | Feruloyl-CoA | p-Coumaroyl-CoA | Feruloyl-CoA | p-Coumaroyl-CoA | |
| Wild type | 3.96 | 0.05 | 70.2 | 100 | 0.0566 | 0.0005 |
| T154A | 0.74 | 0.02 | 155 | 70 | 0.0048 | 0.0003 |
| Y310F | 0.47 | ND | 132 | ND | 0.0036 | ND |
| T154Y | 17.24 | 8.42 | 63 | 113 | 0.2736 | 0.0745 |
| SbCCR2 | 3.24 | 0.50 | 247 | 14 | 0.0131 | 0.0358 |
| Sobic.002G146000 | 0.05 | 0.09 | 7.0 | 52 | 0.0072 | 0.0017 |
| Sobic.010G066000 | 0.04 | 0.00 | 8.0 | 5.0 | 0.0049 | 0.0000 |
讨论
活性位点、酶反应动力学及催化机制
我们的动力学数据表明，SbCCR1对阿魏酰-CoA作为底物有很强的偏好，相比之下，其他两种测试的羟基肉桂酰-CoA硫酯化合物的活性较低（图6A和图7）。基于这种底物偏好，重新审视了底物结合口袋，以确定SbCCR1与阿魏酰-CoA的苯丙烷部分之间的具体结合相互作用。
尽管它在我们的Dali和BLAST搜索中并非匹配度最高，但来自葡萄（V. vinifera）的二氢黄酮还原酶（DFR），其催化NADPH依赖的二氢槲皮素还原，是唯一提供底物三元复合体结构的酶（Trabelsi等人，2008）。鉴于二氢黄酮和阿魏醛在化学结构上的关键相似性，以及SbCCR1含有DFR底物结合残基的功能类似物，我们认为DFR是合适的比较模型。该还原酶（PDB标识符2C29）的结构数据显示，酶通过两个残基（天冬酰胺133和天冬酰胺227）的极性侧链与底物芳环上的3位和4位羟基结合（Trabelsi等人，2008）。SbCCR1与二氢黄酮还原酶的α-碳骨架叠加良好，r.m.s.d.值为1.38 Å。结构对比显示，SbCCR1的苏氨酸154和酪氨酸310的侧链在空间中的位置几乎与二氢黄酮还原酶中天冬酰胺133和天冬酰胺227的侧链相同，暗示苏氨酸154和酪氨酸310可能是它们的功能类似物。我们对阿魏醛的分子对接结果和T154A、T154Y以及Y310F突变体的动力学分析表明，这两个残基在阿魏酰-CoA的结合中有重要作用。总体而言，这些结构和动力学数据，加上一个结构上密切相关的同源酶的底物结合模式，强烈表明SbCCR1中的苏氨酸154和酪氨酸310直接参与了阿魏酰-CoA的结合。
在提出的结合机制中，苏氨酸154的羟基质子与配体的3-甲氧基氧原子相互作用，而对位羟基与酪氨酸310的羟基侧链形成氢键，如对接复合体中所示（图3C）。该机制与之前的发现一致，即具有4-甲氧基取代的底物类似物相比内源底物抑制作用较弱（Baltas等人，2005）。鉴于谷氨酰胺245与结合的阿魏酰-CoA的近距离，其侧链也可能与底物的对位羟基相互作用，而该羟基通过与酪氨酸310的氢键保持所需的构象。生成了Q245L突变体以测试这一残基是否对酶活性至关重要，但该突变蛋白未能以足够水平表达以进行蛋白质纯化。然而，CCR1在谷氨酰胺245处进行氨基酸替代的动力学分析将有助于进一步理解CCR1与羟基肉桂酰-CoA底物之间的结合相互作用，以弥补缺少复合晶体结构的不足。
本研究的新发现大大丰富了对CCR及其相关还原酶反应机制的认识。NADPH和阿魏酰-CoA分别与靠近N端和C端的结合口袋结合。酪氨酸310结合阿魏酰-CoA的对位羟基，而苏氨酸154结合该分子的3-甲氧基（图8）。考虑到两种底物在结合时的显著重叠，它们可能遵循有序的顺序机制，即先结合NADPH，然后是羟基肉桂酰-CoA底物。在第一个催化步骤中，pro-R氢化物从NADPH的C4原子转移到底物的活性硫酯羰基。生成的氧阴离子暂时由丝氨酸149和酪氨酸183的侧链羟基形成的氧阴离子洞稳定。四面体中间体的崩塌随后伴随着C-S键的断裂和CoA硫醇的质子化。正如我们的ITC数据所示，在NADP+存在下，CoA酯化合物的亲和力非常低，这排除了非生产性复合物的形成。
图8. SbCCR1的催化反应机制示意图。 利用NADPH的还原电位，SbCCR1催化羟基肉桂酰-CoA底物的氢化反应，生成羟基肉桂醛和CoASH。参与底物结合的苏氨酸154和酪氨酸310与芳香环周围的官能团形成氢键。
CCR特征残基及底物特异性的残基标准
迄今为止，所有已确认的CCR都共享181NWYCY185的序列特征。虽然这一特征中的中心酪氨酸（SbCCR1中的酪氨酸183）已知参与酶的催化（Jörnvall等人，1995），但其余三个残基的作用似乎在结构上通过定位酪氨酸183的酚侧链发挥作用。在SbCCR1中，色氨酸182的侧链通过疏水相互作用与附近的脯氨酸117和酪氨酸185相结合。此外，色氨酸182的侧链还与赖氨酸177的侧链形成氢键。由于酪氨酸185和脯氨酸117的侧链分别通过面对面或面边相互作用与色氨酸环相互作用（Samanta等人，2000），因此用其他残基替代色氨酸182可能会破坏包含保守NWYCY特征的α螺旋（α7），从而直接影响酶的催化及CoA基团的结合。SbCCR1的电子密度图确实揭示了色氨酸182的吲哚环吡咯部分与脯氨酸117侧链之间的面对面相互作用，同时酪氨酸185的侧链取向有助于与色氨酸182的吲哚侧链形成面边相互作用。此外，半胱氨酸184与半胱氨酸176非常接近，研究表明在氧化条件下这两个残基有助于胱氨酸的形成（Pan等人，2014）。在这些条件下观察到40%的活性丧失，说明在这一区域的CCR还原增加了灵活性，使羟基肉桂酰-CoA的结合更紧密。至于天冬酰胺181的作用尚不清楚，但它可能参与羟基肉桂酰-CoA底物的结合。
在多个物种中已鉴定出的两个CCR，CCR1和CCR2，目前主要通过表达差异（Pichon等人，1998；Lauvergeat等人，2001）或底物特异性（Zhou等人，2010）来区分。然而，关于基于底物偏好的特征序列的知识仍不清楚，这与它们的遗传身份并不完全一致，表明有必要在蛋白质水平上找到识别功能二分法的标准（Escamilla-Treviño等人，2010；Zhou等人，2010）。复杂的是，底物特异性的基本基础迄今尚未明确。如图6A和图7所示，我们的数据表明，SbCCR1对阿魏酰-CoA的偏好明显高于对p-香豆酰-CoA或咖啡酰-CoA的偏好。通过对突变体酶活性数据的分析（图6B）和ITC结果（图3），可以清楚地看出SbCCR1中的苏氨酸154参与了对阿魏酰-CoA的亲和力调节。具有苏氨酸的CCR的一个共同特征是它们对阿魏酰-CoA表现出比其他CCR更高的偏好。虽然PhCCR1、MtCCR1、MtCCR2、Sobic.002G146000和SbCCR2在该位置具有酪氨酸并对阿魏酰-CoA表现出较高的活性，但它们的催化速率和效率与阿魏酰-CoA和p-香豆酰-CoA或咖啡酰-CoA相比的差异远不如体外实验观察到的PvCCR1a（Escamilla-Trevino等人，2010）和SbCCR1。后两种酶在相应位置具有苏氨酸。与这一观察一致的是，T154Y SbCCR1突变体表现出显著更广的底物特异性和更高的转化率。SbCCR1对阿魏酰-CoA活性显著更高，这表明其他两个羟基肉桂酰-CoA底物可能以一种方式与SbCCR1结合，使得它们的活性硫酯键未能有效与NADPH进行氢化物转移。如果这是真的，那么底物特异性的物理基础可能不仅是苯丙烷结合残基的差异，还与保守的酪氨酸（SbCCR1中的酪氨酸310）与烟酰胺环的接近性有关。
我们通过结构指导的搜索，在高粱基因组数据中找到了四个含有NWYCY序列的候选CCR，预计它们会表现出CCR活性。Sobic.002G146000是ZmCCR2的同源物（Pichon等人，1998），根据MOROHOSHI转录组数据库（Makita等人，2015），该基因在高粱根中强烈表达，尽管表达水平低于SbCCR1。Sobic.003g116800在根中也有表达，但仅在氮胁迫下表达。剩下的两个基因，SbCCR2和Sobic.010G066000，在所有测试的条件和组织中表达较低，可能在次生细胞壁的木质化中不起重要作用。通过与SbCCR1相同的方法，我们成功纯化了重组SbCCR2、Sobic.002G146000和Sobic.010G066000。虽然Sobic.002G146000和Sobic.010G066000在阿魏酰-CoA和p-香豆酰-CoA上的活性较低，但SbCCR2对p-香豆酰-CoA的活性相对比SbCCR1高得多。SbCCR2在与SbCCR1中的苏氨酸154对应的位置含有酪氨酸，因此它们的活性与其他在该位置具有酪氨酸的CCR一致。鉴于这些一致性，可能在这一位置拥有苏氨酸驱动了对阿魏酰-CoA的强烈偏好，而具有酪氨酸（或可能是其他残基）则使CCR具有更广泛的还原能力。p-香豆酰-CoA是许多与植物防御相关的苯丙烷类化合物的前体。因此，观察到的SbCCR2的底物多样性可能与植物防御病原体有关，包括在受攻击部位产生防御性木质素。通过扩大底物特异性以包括对p-香豆酰-CoA的显著活性（作为黄酮类和芪类的前体，该底物非常丰富），将更快地产生单木质素。此外，含有对羟基苯丙醇的木质素交联更多，因为酚环的C3和C5都可以参与与生长中的木质素聚合物的自由基偶联反应。与此假设一致的是，研究表明，植物在应对病原体攻击时形成的防御木质素在多种物种中具有更高比例的H单位（Lange等人，1995；Pomar等人，2004；Zhang等人，2007）。Sobic.002G146000和Sobic.010G066000的活性在阿魏酰-CoA和p-香豆酰-CoA上都非常低，表明这两种假定的酶在体内可能具有不同的底物。
结论
减少木质素含量可以降低从木质纤维素生物质中高效生产可再生燃料和化学品的障碍。基于这一目标，CCR活性对于所有主要单木质素的合成都是必需的，这使CCR成为通过突变和转基因方法来修改该途径这一步骤的有吸引力的靶标。通过分子对接、突变和动力学分析，我们发现了一个关键残基——苏氨酸154，它在阿魏酰-CoA这一SbCCR1优选底物的苯丙烷部分结合中起着重要作用。基于与CCR1的结构和序列相似性，我们还在高粱中识别出了四个额外的CCR或CCR类似酶，并通过对两个表达量最高的SbCCR基因编码的CCR的动力学分析，确定了一个可用于基因编辑方法的底物特异性标志残基。这些详细的结构和其他机制知识为工程化单木质素生物合成酶奠定了基础，这些酶显示出改变的底物特异性、减少的底物或产物抑制，或者具有更高的反应速率，从而可以调节代谢流量。该方法的潜力通过SbCCR1中单一氨基酸突变T154Y得到体现，导致了更快的转化率和更广泛的底物特异性。总的来说，这些发现提供了结构信息、结合残基参与的实验证据，以及高粱中以前未识别的CCR基因的信息。
材料与方法
化学品和酶
化学品由Sigma-Aldrich或Fisher Scientific提供。晶体筛选试剂由Hampton Research和Qiagen提供。
克隆与酶纯化
来自高粱（Sorghum bicolor）的编码SbCCR1（Sobic.007G141200）、SbCCR2（Sobic.004G065600）、Sobic.002G146000和Sobic.010G066000的cDNA被连接到pET30a（EMD Millipore）的6×His标签序列下游用于SbCCR1，或连接到pET45a用于Sobic.002G146000和SbCCR2，并通过热冲击转化引入大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞（EMD Millipore）。
表达SbCCR1的大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株培养物（1.5 L）或表达SbCCR2、Sobic.002G146000或Sobic.010G066000的3 L培养物在37°C下生长于Luria-Bertani培养基中，随后表达重组酶。通过向培养基中添加50 µg mL⁻¹卡那霉素和30 µg mL⁻¹氯霉素（用于SbCCR1）或100 µg mL⁻¹氨苄青霉素和30 µg mL⁻¹氯霉素（用于所有其他CCR）来提供菌株选择性。对于带His标签的CCR表达和纯化，所有培养物生长至OD600 = 0.6，然后在各自的诱导温度下进行表达（SbCCR1为20°C，其他酶为22°C），通过加入0.5 mM IPTG进行诱导并震荡20小时。通过5,000g离心收集细胞，冷冻后悬浮于35 mL pH 8的50 mM Tris-HCl缓冲液中，补充300 mM NaCl和20 mM咪唑。通过超声破碎细胞，15,000g离心清除裂解液。将裂解液与10 mL Ni-NTA琼脂糖树脂（Qiagen）搅拌，使用裂解缓冲液的2倍体积洗涤柱子，使用50 mM Tris碱（pH 8）、300 mM NaCl和250 mM咪唑的缓冲液洗脱重组酶。洗脱样品浓缩并更换至20 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液，随后应用于10 mL MonoQ柱（GE Healthcare），酶通过50 mM NaCl梯度洗脱。所有CCR在约150 mM NaCl处洗脱，随后更换缓冲液并浓缩用于晶体学或生化实验。通过SDS-PAGE监测蛋白纯度，并使用BSA作为标准通过Bradford法测定蛋白浓度。
蛋白质晶体生长与结构测定
SbCCR1晶体通过悬滴蒸气扩散法生长。用于结晶的纯化蛋白浓缩至20 mg mL⁻¹，并在20 mM Tris碱（pH 7.5）、2 mM DTT和1 mM NADP+中，与等体积的储液混合后平衡，储液成分为100 mM Bis-Tris（pH 6.5）和25%（w/v）PEG 3350，晶体通常在5天内形成。
底物合成与纯化
阿魏酰-CoA、咖啡酰-CoA和p-香豆酰-CoA的合成参照了之前描述的方法（Walker等人，2013），但进行了轻微修改。简而言之，底物是通过将重组的4-香豆酸连接酶加入到含有50 mM pH 7的磷酸钠缓冲液、800 μM CoA、2.5 mM ATP、2 mM阿魏酸、p-香豆酸或咖啡酸以及5 mM氯化镁的溶液中进行酶促反应制备的。反应体积范围为20至50 mL，温和摇动不少于16小时后终止。通过在80°C下对酶进行10分钟的热变性终止反应，随后以15,000g离心30分钟。通过真空离心收集上清液中的溶质。使用乙醇纯化底物以使剩余的反应组分结晶。含有纯净羟基肉桂酰-CoA酯的剩余液体通过真空离心收集沉淀并存储在−20°C以备后用。
酶动力学分析
纯化的野生型SbCCR1、其突变体以及所有其他酶被用于稳态动力学实验，底物包括p-香豆酰-CoA、咖啡酰-CoA和阿魏酰-CoA。对于不同硫酯底物浓度的实验，70 μL反应液含有50 mM Bis-Tris（pH 6.5）、1 mM NADPH、1 μg酶，以及1、2、5、10、20、50、100、200、500或1,000 μM的硫酯底物。所有反应在30°C下进行，在不同的孵育时间后通过加入30 µL 17%（v/v）三氟乙酸终止反应（反应时间从30秒（用于SbCCR1和T154Y SbCCR1突变体）至20分钟（用于Sobic.002G146000、Sobic.010G066000和T154A SbCCR1突变体））。反应液通过21,000g离心30分钟以沉淀蛋白质聚集体。每个反应的50 μL样品被注入Luna C18(2) 5 μm、4.6-mm × 150-mm柱（Phenomenex），使用Hitachi Organizer HPLC单元分离，反应生成的相应醛产物通过333或346 nm吸收曲线积分定量。所有反应均进行三次，并使用Origin 7.1版本软件（OriginLab）处理数据。
阿魏醛对接
使用AutoDock Vina（Trott和Olson，2010）进行SbCCR1与阿魏醛的分子对接。计算中使用的文件通过AutoDock Tools 1.5.6（Trott和Olson，2010）准备。搜索空间（x = 14 Å，y = 8 Å，z = 22 Å）是根据苯丙烷结合域的可能位置定义的。阿魏醛通过COOT程序构建，使用GaussView3（Gaussian）进行结构优化，并通过与4-香豆酸连接酶（PDB标识符5BSV）中的阿魏酸腺苷酰化合物的晶体结构进行对比验证。
定点突变与突变体表达
为了测试它们在阿魏酰-CoA结合中的作用，SbCCR1中的两个残基，苏氨酸154和酪氨酸310，分别被突变为丙氨酸（A）和苯丙氨酸（F）。T154A突变体通过以下引物生成：正向引物，5′-TCCATCCGCGCGGTGGCCATGGACCCCAGC-3′，反向引物，5′-GCTGGGGTCCATGGCCACCGCGCCGATGGA-3′。Y310F突变体通过以下引物生成：正向引物，5′-CGCGGAAGCAGCCGTTCAAGTTCTCGAACCAG-3′，反向引物，5′-CTGGTTCGAGAACTTGAACGGCTGCTTCCGCG-3′。此外，还生成了T154Y突变体以观察底物特异性的变化。生成该突变体使用的引物序列如下：正向引物，5′-CATCGGCGCGGTGTACATGGACCCCAGC-3′，反向引物，5′-GCTGGGGTCCATGTACACCGCGCCGATG-3′。含有SbCCR1 cDNA序列中所需错义突变的质粒通过热冲击转化进入大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞，蛋白质表达按照上述程序进行。
ITC（等温滴定量热法）
在ITC200仪器（Malvern Instruments）中对野生型或突变型SbCCR1与几种配体进行了等温量热滴定。蛋白质通过广泛的缓冲交换（超过10,000倍）制备到滴定缓冲液中，该缓冲液由10 mM磷酸钠（pH 7）组成。滴定池中的蛋白质浓度稀释至50 μM。所有滴定在25°C下以750 rpm搅拌速度进行，共27次注射（每次1.4 µL）。所有配体在滴定缓冲液中的浓度为1 mM，并注入蛋白质溶液中，记录结合热。
登录号
本研究中的结构数据可以在蛋白质数据库（PDB）中找到，登录号为5TQM。